Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1-  Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2-  Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).

3-   Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.

4-  Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristalatau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring.

Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain:

a1.   Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).

b2. Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan.

c3.  Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll.

Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak ada.

·    

   Cara pewarnaan Gram

1. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen.
2. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 5 menit.
3. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-3 menit.
4. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).
5. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.
6. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif  = ungu. Gram negatif = merah.